Под собирательным названием «сальмонеллез» объединяют болезни, которые первично вызываются бактериями рода Salmonella и обычно протекают с явлениями септицимии или с подострым, иногда хроническим течением и воспалением желудочно-кишечного тракта, поражением печени, органовдыхания, суставов или абортами у самок.
Сальмонеллез - заболевание сельскохозяйственных животных всех видов, птиц, пушных зверей и дикой фауны. У молодняка в возрасте от 10 дней до 4 мес заболевание протекает остро, в септической форме, сопровождаясь подъемом температуры тела, энтеритом, бронхопневмонией, артритами и параличами. У взрослых животных отмечаются бактерионосительство, аборты, периоды обострения.
У человека токсикоинфекции вызывают сальмонеллы, адаптированные к организму животных и птиц.
С 1980-х гг. различные болезни животных, относящиеся к сальмонеллезам, описывались под разными названиями. В 1885 г. Сальмон выделил в чистой культуре первого возбудителя сальмонеллеза S. chol- егае (прежнее название S. suipestifer), которого долгое время считали возбудителем чумы свиней. Шотмюллер в 1890 г. назвал паратифом заболевание людей, возбудителями которого являются S. paratiphy А и В, так как симптомы болезни сходны с брюшным тифом. Впоследствии массовые болезни животных, вызываемые сходными с S. paratiphy бактериями, также назвали паратифами. Однако это название устарело и заменено. Пфейфер, Мюллер и Биттер установили, что S. paratiphy А и В патогенны только для человека, в то время как виды и разновидности, выделяемые от животных и птиц, вызывают токси- коинфекции у человека.
Сальмонеллы в последнем издании «Краткого определителя бактерий» Берги отнесены к семейству Enterobacteriaceae, трибу Escheri- chiaee, роду Salmonella, семейству Enterobacteriaceae и включают 12 родов: Escherichia, Edwardsiella, Citrobarter, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Proteus, Erwinia, Jersinia. Род сальмонелл включает 65 групп (более 2000 сероваров). Международным номенклатурным комитетом род сальмонелл разделен на четыре подрода (табл. 15.1):
1. S. kauffmanni. Включает большую часть патогенных для человека сальмонелл, серологических групп А, В, С, Д, Е.
Таблица 15.1
Биохимическая дифференциация сальмонеллез
Условные обозначения : н--положительная;--отрицательная; Р - разная;
- (+) - поздняя, но всегда положительная; х - поздняя, но не постоянно положительная
- 2. S. salamae. Отличается от первого подрода способностью разжижать желатин и ферментировать малонит натрия.
- 3. S. arizonae. Ферментирует лактозу, обнаруживается у птиц, рептилий, млекопитающих; в последние годы обнаруживается у человека при лихорадочных состояниях с явлениями диареи и гастроэнтерита.
- 4. S. houtenau. Отнесены атипичные в биохимическом отношении сальмонеллы.
Общие культурно-биохимические признаки представителей рода сальмонелл (за малым исключением) позволяют отличить их от других групп семейства энтеробактерий и сходных с ними групп (Edwardsiella и Citrobacter).
Для биохимической идентификации Citrobacter и четырех подродов сальмонелл в практике используют пять тестов: наличие желатиназы, утилизация лизиата, лактозы, глицерина и декарбоксилирование лизина.
Кауфман подразделил род сальмонелл на четыре подрода в соответствии с их антигенной структурой (табл. 15.2).
Антигенная структура сальмонелл
|
Группа и вид (серовар) |
Антигенная структура |
||
|
Соматический антиген |
Жгутиковый антиген |
||
|
Специфическая фаза |
Неспецифическая фаза |
||
|
S. paratyphi А |
|||
|
S. typhimurium |
|||
|
S. abortus-equi |
|||
|
S. abortus-ovis |
|||
|
S.paratyphi В |
|||
|
S. abortus-bovis |
|||
|
S. cholerae-suis |
|||
|
S. typhi-suis |
|||
|
S. enteritidis |
|||
|
S. dublin |
|||
|
S. rastoc |
|||
|
S. gallinarum |
|||
|
S. pullorum |
|||
Биологические свойства. Бактерии семейства сальмонелл имеют следующие общие свойства: они грамотрицательны, не образуют спор, лишены оксидазы, восстанавливают нитраты в нитриты, ферментируют глюкозу, хорошо растут на обычных средах, факультативные анаэробы.
Морфология. Это мелкие с закрученными концами палочки длиной I -3 и диаметром 0,5-0,8 мкм, как правило, подвижны, кроме S. gal- linarum и S. риllorum. Неподвижные мутанты встречаются среди других видов. Капсул они не образуют. Их колонии имеют диаметр 2-4 мм. На МПА - прозрачные, нежные, голубоватые, на среде Эндо - розовые, прозрачные, на среде Плоскирева - бесцветные, на среде Левина - прозрачные с фиолетовым оттенком, на висмут-сульфитагаре - черные с металлическим блеском, под колонией среда чернеет.
Ферментативные свойства разнообразны не только у одного подрода, они могут варьировать в пределах одного и того же серовара. Сальмонеллы образуют сероводород и не образуют индола, не ферментируют лактозу и салицин, утилизируют цитрат, ферментируют глюкозу и маниит. В новейших научных исследованиях сальмонеллы дифференцируют по 26 биохимическим тестам.
Устойчивость. Длительно сохраняются и обладают высокой устойчивостью эндотоксины сальмонелл. Их токсическое действие не ослабевает в толще мяса при варке больших кусков. При температуре 65-70 °С сальмонеллы выживают длительное время, не погибают в 8-10%-м растворе уксусной кислоты в течение 18 ч. В почве, навозе, помете сальмонеллы сохраняются несколько лет и могут размножаться в отложениях из фекалий в стойлах для свиней, в жидких кормах, воде, почвах, удобренных навозом. Они размножаются во всех пищевых продуктах при достаточной влажности и температуре (7- 45 °С), pH от 4,1 до 9,0. Используемые для дезинфекции 3%-й раствор гидроокиси натрия, хлорная известь, содержащая 2%-й активный хлор, 20%-я взвесь свежегашеной извести, 2%-й раствор формальдегида надежно обеззараживают помещения при экспозиции 1-1,5 ч. Обеззараживание инфицированной сальмонеллами почвы загонов и пастбищ проводят по методу, разработанному С.М. Губкиным (1953).
Токсигенность. Сальмоннеллы обладают эндо- и экзотоксинами. Эндотоксины вызывают геморрагическое воспаление кишечника и являются причиной диареи и других признаков болезни. Экзотоксины относятся к группе нейротоксинов. Действие токсинов сопровождается диспепсией, энтероколитами, поражением центральной нервной системы при этом повышается температура тела, появляется одышка, нарушается координация движений, ослабевают рефлексы. В случаях нарастания интоксикации у животных появляются судороги.
Антигенная структура сальмонелл сложна. Они имеют несколько антигенов: О, Н, VI, М и К. О-антиген термостабилен (выдерживает кипячение в течение 2,5 ч), угнетается формалином, располагается на поверхности клетки и состоит из фосфолипидополисахаридных комплексов. Специфичность О-антигена в серологических реакциях обусловлена присутствием в нем определенных полиозидов, т.е. сахаров дидезоксигексоз, располагающихся на концах полисахаридных цепочек. Серологические варианты сальмонелл по О-антигену обозначают арабскими цифрами.
Одним из компонентов соматического антигена является Уь антиген, принадлежащий к К-антигенам. После открытия Уьантигена (Феликс и Ритт, 1934) его назвали антигеном вирулентности. Но он не служит, как теперь доказано, прямым носителем вирулентности. Его присутствие на поверхности микробной клетки препятствует аг- глютинабельности бактерий в О-сыворотке, что затрудняет дифференциацию сальмонелл. Уьантиген - полимер, он термолабилен.
Уьантиген является лабильным веществом, он исчезает при выращивании микробов в питательных средах при добавлении к ним фенола, а так же при низкой (20 °С) или высокой (40 °С) температурах, полностью разрушается при кипячении и под действием фенола, частично изменяется под воздействием формалина и температуры 60 °С в течение 30 мин.
Жгутиковый Н-антиген неоднороден; он состоит из двух фаз: первой, или специфической фазы, агглютинирующейся специфической видовой сывороткой, и второй, или неспецифической фазы, агглютинирующейся не только видовой, но и групповой сывороткой. Сальмонеллезы, имеющие две фазы Н-антигена, называют двухфазными в отличии от монофазных, имеющих только специфический Н-анти- ген. Н-антиген термолабилен, устойчив к формалину, чувствителен к кислотам и алкоголю, по природе протеин.
Антигенная структура сальмонелл подвержена изменчивости. Их антигенные комплексы подвержены внезапным вариациям при переходе из Б- в Я-форму, а также в результате трансдукции, лизогенной конверсии и конъюгации.
Различают несколько видов диссоциации сальмонелл:
- 1) Н-О-вариации, т.е. переход от жгутиковой к безжгутиковой форме;
- 2) И.-, 8-вариации, т.е. переход от гладкой к шероховатой форме. В изотоническом растворе хлористого натрия 11-формы дают нестойкий агглютинат, а Б-формы остаются во взвешенном состоянии.
- 3) У-У-вариации касаются только Уьантигена. У-форма содержит Уьантиген и является О-неагллютинабельной. У-форма не содержит Уьантигена и считается О-агглютинабельной. Встречаются промежуточные формы.
В практике серологической дифференциации сальмонелл, несмотря на вариабельность их антигенной структуры, во внимание принимается лишь три основных антигена (О, Н, VI).
Характеризуя свойства сальмонелл, нельзя не остановиться на их так называемой генетической пластичности, на связи последней у этих микроорганизмов с множественностью их сероваров и на вопросе о том, в какой мере эта генетическая пластичность может отразиться на возможности их точной идентификации.
Сальмонеллы в последние годы часто избирались в качестве моделей для генетических исследований. Уже упоминалось о естественной вариации антигенных структур бактерий. Известны также вариации, возникшие под влиянием бактериофагов и других факторов. Выше было названо три механизма генетической рекомбинации, встречающиеся у сальмонелл. Явление трансдукции у сальмонелл описано в 1952 г. Циндером и Леденбергом. При этом умеренный бактериофаг РТ22, воздействуя на различные серовары, мог осуществлять трансдукцию Н-антигена и его других свойств. На основании этого авторы не исключают возможности такого рода изменений микроорганизма в естественных условиях.
При лизогенной конверсии гены бактериофага передают функцию как часть бактериальной клетки. Состояние лизогенности, вызванное конвертирующим фагом, ведет к изменению в О-антигенах. При этом вновь приобретенный О-антиген сохраняется до тех пор, пока микроб остается лизогенным.
С помощью конъюгации возникают гибриды с новыми антигенными свойствами. При конъюгации возможна передача плазмид и появление фактора резистентности (Я-фактора) или нового свойства. Проблемой современности является широкое распространение по- лирезистентных к лекарственным веществам форм сальмонелл.
Из вышеизложенного понятны проблемы и сложности идентификации сальмонелл, необходимость систематического определения сероваров выделенных культур, изучения их антибиотикорезистент- ности и ее преодоления.
Для серологической типизации выделяемых штаммов сальмонелл используют рецепторный анализ с применением специфических агглютинирующих сальмонеллезных сывороток как групповых, так и видовых.
Иммунитет носит антиинфекционный и антитоксический характер. Как правило, сначала возникает нестерильный иммунитет, который в дальнейшем может стать стерильным. Иммунитет часто возникает в результате скрытого переболевания. Такой иммунитет называют депрессионным.
В создании иммунитета существенное значение имеет первая доза антигена. Чрезмерная доза вызывает угнетение иммунных сил организма, особенно у молодняка. Малые дозы обычно нейтрализуются организмом и, следовательно, не вызывают выработки иммунитета. Оптимальной иммунизирующей дозой некоторые авторы считают 2 мл микробных тел.
Для формирования стойкого иммунитета необходима определенная степень и продолжительность антигенного воздействия (персистенция живых бактерий в тканях). В связи с этим прививки в ранний постнатальный период не дают желаемого эффекта, как и сочетание иммунизации с применением антибиотикотерапии. Ведущим антигеном в иммуногенезе считается О-антиген. На первых стадиях формирования иммунитета образуются 1 2 М и 1 2 0. Под влиянием живых вакцин, начиная со 2-й недели, происходят образование антител и усиление фагоцитарной реакции, которые к 5-6-й неделе достигают своего максимума.
Патогенез. Длительность инкубационного периода зависит от метода инфицирования, дозы и вирулентности возбудителя и иммунного состояния организма. В естественных условиях продолжительность инкубационного периода у молодняка разных видов животных составляет от 2-5 до 10-25 дней. При алиментарном пути заражения возбудитель быстро проникает в лимфатический аппарат кишечной стенки, а оттуда - в лимфо- и кровообращение. Пейеровы бляшки и солитарные фолликулы увеличиваются, отчетливо выступая под слизистой, образуя возвышения.
Оглавление темы "Шигеллы. Дизентерия. Сальмонеллы. Сальмонеллезы.":Морфология сальмонелл. Культуральные свойства сальмонелл. Биохимические признаки сальмонелл.
Род Salmonella представлен мелкими бактериями вытянутой формы с закруглёнными концами размером 0,7-1,5x2-5 мкм. Капсул бактерии не имеют.
Большинство изолятов сальмонелл подвижно (перитрихи), но существуют неподвижные мутанты и серовары. хемоорганотрофы, оксидаза-отрицательны, каталазаположительны.
Температурный оптимум сальмонелл составляет 35-37 °С, оптимум рН - 7,2-7,4. Рост сальмонелл подавляют или ограничивают высокие концентрации хлорида натрия и сахара. На питательных средах сальмонеллы образуют типичные для большинства энтеробактерий мелкие (2-4 мм) прозрачные S-колонии. Также они формируют шероховатые и сухие R-колонии. На агаре Эндо S-колонии розоватые и прозрачные, на агаре Плбскирева - бесцветные и выглядят более плотными и мутноватыми, на висмут-сульфитном агаре - чёрно-коричневые, с металлическим блеском, окружены чёрным гало, среда под колониями окрашивается в чёрный цвет. Исключение составляют S. paratyphi A, S. choleraesuis и некоторые другие, образующие на висмут-сульфитном агаре коричнево-зеленоватые колонии (рис. 25, см. цветную вклейку). На бульоне S-формы дают равномерное помутнение среды; R-формы - осадок.
Биохимические признаки сальмонелл
Биохимические признаки сальмонелл представлены в таблице ниже. Характерные свойства сальмонелл - образование H 2 S и отсутствие индолообразования (исключая некоторые серовары).
Род Salmonella объединяет более 2000 представителей, широко распространенных в природе. Они вызывают заболевания у человека и животных. К роду сальмонелл относятся возбудители брюшного тифа, паратифов А и В и пищевых токсикоинфекций.
Возбудитель брюшного тифа (S. typhi) был впервые обнаружен в 1880 г. Эбертом в органах людей, умерших от брюшного тифа. В 1884 г. Гаффки выделил чистую культуру микроба. Позднее, в 1896 г., Ашар и Бансод нашли в гное и моче больных, у которых наблюдалась клиническая картина брюшного тифа, палочки, по биохимическим и серологическим свойствам отличающиеся от возбудителя брюшного тифа. Они были названы паратифозными— S. paratyphi А и S. paratyphi В. Из возбудителей пищевых отравлений первым был открыт в 1885 г. Сальмоном возбудитель холеры свиней — S. cholerae suis. В 1888 г. Гертнер при вспышке пищевых токсикоинфекций после употребления в пищу мяса больной коровы выделил S. enteritidis. В дальнейшем были описаны сальмонеллы мышиного тифа — S. typhimurium и другие микробы, которые по ряду признаков были сходны между собой, и объединены в род Salmonella, названный в честь Сальмона.
Морфология и биологические свойства. Сальмонеллы представляют собой короткие палочки с закругленными концами, размером в среднем 1—3 мкм. Все они подвижны благодаря наличию перитрихиально расположенных жгутиков. Спор и капсул не образуют. Хорошо окрашиваются анилиновыми красками, грамотрицательны. Факультативные аэробы. Хорошо растут на простых питательных средах при температуре 20—40°С и рН от 5,0 до 8,0 при оптимуме 37°С и рН 7,2—7,4. Па жидких средах дают равномерное помутнение. На мясо-пептонном агаре колонии более мелкие, чем у кишечных палочек, нежные, полупрозрачные. На дифференциально-диагностических средах Эндо, Левина, Плоскирева колонии мелкие, бесцветные. На висмут-сульфит-агаре колонии черного цвета.
Ферментативные свойства сальмонелл (см. табл. 3) довольно постоянны: не разлагают лактозу и сахарозу, ферментируют глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа, хотя встречаются типы, ферментирующие их только до кислоты (например, сальмонелла тифа). Большинство сальмонелл расщепляет белки с образованием сероводорода, не образует индола, не разжижает желатина. Сальмонеллы содержат эндотоксин липополисахаридно-протеиновой природы. Он термоустойчив, обладает антигенными свойствами.
Устойчивость. Сальмонеллы устойчивы во внешней среде. В пыли, во льду, в чистой воде сохраняются до З мес. При температуре 70°С гибнут в течение 5—10 мин, при 10°С — мгновенно. В соленом и копченом мясе саль-монеллы сохраняют жизнеспособность 27,2 мес. В молоке могут размножаться. Под действием 1 % раствора сулемы, 3—5% раствора карболовой кислоты и хлорамина погибают в течение нескольких минут.
Антигенная структура и классификация. Сальмонеллы содержат два основных антигенных комплекса: О-соматический и Н-жгутиковый. О-антиген — липополисахаридно-протеиновый комплекс, термостабилен, инактивируется под действием формалина, соответствует эндотоксину бактериальной клетки. Н-антиген белковой природы, термолабилен, легко разрушается спиртом и фенолом. Устойчив к действию формалина. На этом свойстве основано получение Н-диагиостикумов. О- и Н-антигены у различных представителей сальмонелл неоднородны, что было положено в основу классйфйкации этих бактерий, разработанной Кауфманом й Уайтом (табл. 4).
Они разделили все сальмонеллы по О-антигенам на группы: А, В, С, D, Е и т. д. Каждая группа характеризуется наличием определенного Оантигена (например, в группе В это «4»). Некоторые группы имеют общие О-антигены (например, группа А, В и D — «1, 12»). Сальмонелла тифа содержит Vi-антиген, который располагается более поверхностно, чем О-антиген, и может препятствовать агглютинации с О-сывороткой. Утрата его ведет к восстановлению О-агглютинации. Vi-антиген легко разрушается при кипячении культуры в течение 10 мин, при добавлении в среду фенола, выращивании микроба на искусственных средах.
У Н-антигенов сальмонелл различают I и II фазы. Первая фаза Н-антигенов различна у серотипов, входящих в одну группу (например, в группе S. paratyphi В— «в», a Salm. typhimurium — «і»). Такое разделение помогает дифференцировать отдельные типы сальмонелл в реакции агглютинации на стекле с монорецепторными сальмонеллезными сыворотками. В реакции агглютинации при взаимодействии Н-антигенов с соответствующими антителами проявляется крупнохлопчатая Н-агглютинация; О- и Vi-агглютинация мелкозернистая.
Помимо серологического типирования сальмонелл, иногда проводят определение фаготипов с помощью специфических сальмонеллезных бактериофагов, которых к настоящему времени известно более 100. Установлено, что одни фаги лизируют сальмонеллы, содержащие О-антиген, другие (Vi-фаги) — только штаммы, содержащие Vi-антиген. Фаготипы сальмонелл стабильны. Метод фаготипирования сальмонелл используется в целях эпидемиологического анализа для выявления источника инфекции.
Патогенность. Среди сальмонелл встречаются типы, патогенные только для человека: сальмонеллы брюшного тифа, паратифов А и В. Есть типы, вызывающие заболевания только у животных. Большинство же патогенно и для человека, и для животных. Разнообразие клинических форм заболеваний, вызываемых сальмонеллами, зависит от свойств возбудителя, массивности заражения, состояния защитных сил макроорганизма и других причин.
В мясопептонный бульон добавляют 3-4% агара, доводят pH до 7,6, разливают в склянки по 100 мл и стерилизуют, как обычно, в автоклаве, сохраняя в таком виде до момента приготовления фуксинсульфитного агара. Готовят фуксинсульфитный агар в день использования. Заготовлять впрок и хранить эту среду нельзя, так как она быстро краснеет.
К 100 мл расплавленного и охлажденного до 70°С 3-4%-ного мясопептонного агара стерильно добавляют 1 г лактозы, предварительно растворив и прокипятив ее в 5 мл стерильной воды. Кроме того, сюда же добавляют 0,5 мл профильтрованного насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 2,5 мл свежеприготовленного 10%-ного раствора сернистокислого натра. Сернистокислый натр (Na2SO3) в количестве 0,5 г растворяют в 5 мл воды и перед употреблением стерилизуют кипячением.
Можно поступить и несколько иначе. Фуксин и сульфит натрия сначала смешивают в пробирке: к 0,5 мл раствора фуксина прибавляют при встряхивании раствор сульфита натрия до тех пор, пока жидкость в пробирке не станет бесцветной или слегка розовой. И в расплавленный и несколько охлажденный агар вливают уже эту смесь. Колбу со средой тщательно встряхивают для перемешивания и среду разливают в чашки Петри. После застывания среды ее подсушивают в термостате при 37 °С в течение 30 мин.
В горячем состоянии среда должна быть слабо-розового цвета, а после остывания совершенно бесцветной. Обесцвечивание фуксина в среде Эндо вызывает введенный сернистокислый натр.
Среда Симмонса
При идентификации микробов группы коли (чтобы отличить почвенный вид Escherichia coli aёrogenes от фекального вида Escherichia coli commune) применяется цитратная среда Симмонса. В 1 л дистиллированной воды растворяют 1,5 г фосфорнокислого натра (или однозамещенного фосфорнокислого аммония), 1 г однозамещенного фосфорнокислого калия (КН2РO4), 0,2 г сернокислого магния, 2,5-3 г кристаллического лимоннокислого натрия, устанавливают pH 7,0-7,2, добавляют 2% агара и, расплавив среду, разливают ее в колбы по 100 мл. Стерилизуют в автоклаве 15 мин при 120°С.
Перед употреблением в среду необходимо добавить индикатор. Можно использовать либо бромтимолблау, либо фенолрот. Индикатор добавляют к 100 мл расплавленной среды. Бромтимолблау берут в количестве 1 мл спиртового 1,5%-ного раствора. Среда приобретает оливково-зеленый цвет. Фенолрот добавляется в количестве 2 мл 1,5%-ного спиртового раствора. Среда окрашивается в желтый цвет. После добавления индикатора среду разливают в пробирки и стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15 мин.
Пестрый ряд углеводов, или среды Гисса
Для определения ферментативной способности микроорганизмов пользуются средами Гисса. В зависимости от наличия в микробной клетке того или иного фермента она способна разлагать какой-либо один из углеводов с образованием определенных продуктов разложения, поэтому в состав среды вводится какой-либо углевод: лактоза, глюкоза, маннит, сахароза и пр. Набор таких сред получил название «пестрого ряда углеводов».
Сначала готовят пептонную воду: на 1 л дистиллированной воды берут 10 г пептона и 5 г химически чистой поваренной соли, кипятят до растворения пептона, фильтруют через бумажный фильтр (фильтрат должен быть совершенно прозрачным) и устанавливают pH 7,2-7,4. Затем к 100 мл пептонной воды добавляют по 0,5 г одного из применяемых углеводов и по 1 мл индикатора Андреде.
В состав индикатора Андреде входит: 0,5 г кислого фуксина, 16 мл 1 н. раствора едкого натра (NaOH) и 100 мл дистиллированной воды. При необходимости индикатор можно готовить заранее и сохранять его в темном месте, предварительно про-кипятив при 100 °С в течение 15 мин. После введения индикатора среды разливают по пробиркам с поплавками и стерилизуют в кипятильнике Коха трижды по 30 мин. По окончании стерилизации поплавки должны быть погружены в среду, в противном случае пробирка не может быть использована. Среды Гисса с реактивом Андреде имеют соломенно-желтый цвет без розового оттенка. При развитии в среде микроорганизмов последние, разлагая сахар с образованием кислоты, вызывают изменение реакции. А так как в кислой среде индикатор Андреде краснеет, то это и является свидетельством, что микроорганизм использует данный сахар для своей жизнедеятельности. Отсутствие покраснения, наоборот, свидетельствует об отсутствии в ферментативном комплексе изучаемого микроба фермента, разлагающего имеющийся в среде углевод.
Ферментативная активность микроорганизмов богата и разнообразна. Она позволяет установить видовую и типовую принадлежность, определить биологические варианты микроба. Существует целый ряд ферментов, по активности которых можно определить степень патогенности микроорганизма.
Для определения ферментативной (биохимической) активности микробов используют дифференциально – диагностические среды.
К дифференциально – диагностическим средам относятся среды Гисса, на которых изучается сахаролитическая активность микрооганизмов.
Среды Гисса могут быть жидкими и плотными. Основу сред Гисса составляют мясо – пептонный бульон (МПБ) и мясо – пептонный агар (МПА). В состав этих сред входит углевод и индикатор. Существуют два ряда сред Гисса – большой (включающий 27 наименований) и малый. Малый ряд сред Гисса включает мальтозу, глюкозу, сахарозу, манит и лактозу. Исходная установка рН среды – слабо щелочная (7,2 – 7,4).
Если при культивировании микробов происходит расщепление субстрата до кислоты, то рН среды изменяется в кислую сторону и при этом происходит изменение цвета индикатора. Изменение цвета питательной среды и является показателем наличия у данного микроба фермента, расщепляющего конкретный субстрат до кислоты. И в жидкой, и в плотной питательной среде о наличии фермента, расщепляющего субстрат до кислоты, судят по изменению цвета индикатора.
Образование газа устанавливают по скоплению пузырьков газа в толще агара и по разрыву агара (если среды Гиса плотные) или по скоплению пузырьков газа в поплавке (если среды жидкие). Поплавок – узкая стеклянная трубочка с запаянным концом, обращенным вверх, которую помещают в пробирку со средой перед стерилизацией среды.
Различие в наборе ферментов, расщепляющих углеводы, может быть использовано при дифференцировке родственных микробов, например, сальмонелл, шигелл, эшерихий. Так, на средах Эндо, Левина, Плоскирева, в состав которых входит лактоза и индикатор (анилиновый краситель), колонии кишечной палочки будут окрашены в фиолетовый цвет (на среде Левина) или в сиреневый (на средах Эндо и Плоскирева). Колонии сальмонелл и шигелл на этих же средах будут бесцветными.
Это обусловлено тем, что кишечная палочка, имея фермент лактазу, расщепляет лактозу, в результате чего образуется кислота, рН среды смещается в кислую сторону и происходит проявление цвета индикатора – анилинового красителя. Особи кишечной палочки хорошо окрашиваются анилиновым красителем, а совокупность окрашенных особей представляет окрашенную колонию.
Шигеллы и сальмонеллы не имеют фермента лактазы и не расщепляют лактозу, рН среды не изменяется, индикатор не проявляется, микробные клетки не окрашиваются. Поэтому колонии сальмонелл и шигелл на средах Эндо и Плоскирева будут бесцветными.
О наличии фермента амилазы можно судить, посеяв культуру на среду, содержащую крахмал. Если есть фермент, расщепляющий крахмал, то при добавлении в пробирку капли раствора Люголя, посинение среды не произойдет. Нерасщепленный крахмал при добавлении раствора Люголя дает синее окрашивание.
Протеолитические свойства (т.е. способность расщеплять белки, полипептиды и пр.) изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте на желатиновой среде микробов, ферментирующих желатин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен.
При расщеплении пептоном могут выделяться индол, скатол, сероводород, аммиак. Их образование устанавливают с помощью индикаторов. Например, фильтровальную бумагу заранее пропитывают раствором индикатора, высушивают, нарезают узенькими полосками длиной 5 – 6 см и после посева культуры на МПБ помещают под пробку (между пробкой и стенкой пробирки). После инкубации в термостате учитываю результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной 20% раствором ацетата свинца и гидрокарбоната натрия, происходит образование сульфата свинца – соли черного цвета, и индикаторная бумажка чернеет. Индол способствует покраснению бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты.
Гемолитические свойства микробов можно выявить, используя кровяной агар. Если микроб имеет фермент гемолизин, то вокруг колоний этого микроба будут зоны лизиса эритроцитов (в этих зонах агар будет бесцветным).
Фермент лецитиназу выявляют при посеве культуры на желточно – солевой агар. Вокруг колонии микроба, продуцирующего этот фермент, образуется матовый ореол.
Следует помнить о том, что наличие различных ферментов определяет биохимические свойства микробов.
Культуральные и биохимические свойства возбудителей пищевых токсикоинфекции
Ферментный состав любого микроорганизма является достаточно постоянным признаком в нормальных условиях, т.е. различные виды микроорганизмов различаются по набору ферментов.
Изучение ферментного состава имеет важное значение для дифференцировки и идентификации различных микроорганизмов.
Специальные методы окраски бактерий. Наибольшее распространение нашли методы Грама и Циля-Нильсена.
Дифференцирующие методы обычно применяют для окрашивания различных морфологических структур.
Капсулы. Для окраски капсул бактерий применяют методы Хисса, Лейфсона и Антони; последний метод наиболее прост и включает окраску кристаллическим фиолетовым с последующей обработкой 20% водным раствором CuSO4.
Жгутики. Для окраски жгутиков предложены методы Лёффлера, Бейли, Грея и др. Для этих методов характерны первоначальное протравливание препарата и последующая окраска (чаще карболовый фуксин Циля).
Споры. Окраску спор бактерий проводят после предварительной обработки их стенок. Наиболее прост метод Пешкова, включающий кипячение мазка с синькой Лёффлера на предметном стекле с последующей докраской нейтральным красным. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки - в розовый.
Методы культивирования
При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ глубинного культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред. В соответствии со способами выращивания бактериальные культуры разделяют на периодические (при стационарном и глубинном культивировании) и непрерывные (при проточном культивировании).
Стационарный способ - наиболее часто используемый на практике. Состав сред остаётся постоянным, с ними не проводят никаких дополнительных манипуляций.
Способ глубинного культивирования применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы. Они снабжены системами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, перемешивания биомассы и постоянной подачи кислорода. Создание аэробных условий по всей толще среды способствует протеканию энергетических процессов по аэробному пути, что способствует максимальной утилизации энергетического потенциала глюкозы и, следовательно, максимальному выходу биомассы.
Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно поддерживать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток. Пребывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различных БАВ (витамины, антибиотики и др.).
Первичная идентификация бактерий
В большинстве случаев изучение особенностей роста для первичной идентификации возбудителей проводят на колониях, выросших в течение 18-24 ч. Характер роста бактерий на различных средах может дать много полезной информации. На практике используют сравнительно небольшой набор критериев. В жидких средах обычно учитывают характер поверхностного (образование плёнки) или придонного роста (вид осадка) и общее помутнение среды. На твёрдых средах бактерии формируют колонии - изолированные структуры, образующиеся в ре зультате роста и накопления бактерий. Колонии возникают как следствие роста и размножения одной или нескольких клеток. Таким образом, пересев из колонии в дальнейшем даёт возможность оперировать с чистой культурой возбудителя. Рост бактерий на плотных средах имеет больше характерных особенностей.
Некоторые бактерии выделяют гемолизины - вещества, разрушающие эритроциты. На КА их колонии окружают зоны просветления. Образование гемолизинов (и соответственно - размеры зон гемолиза) может быть вариабельным, и для адекватного определения гемолитической активности следует просматривать чашки с посевами против источника света (рис. 1-14). Активность гемолизинов может проявляться в полном или неполном разрушении эритроцитов.
α-Гемолиз. Разрушение эритроцитов может быть неполным, с сохранением клеточной стромы. Подобный феномен называют α-гемолиз. Просветление среды вокруг колоний обычно незначительно, позднее среда вокруг колоний может приобретать зеленоватую окраску.
В бактериологической практике чаще всего изучают сахаролитические и протеолитические ферменты
Подобный рост характерен для пневмококка, а также для группы так называемых зеленящих стрептококков.
β-Гемолиз. Гораздо большая группа бактерий вызывает полное разрушение эритроцитов, или β-гемолиз. Их колонии окружены прозрачными зонами различного размера. Например, Streptococcus pyogenes и Staphylococcus aureus образуют большие зоны гемолиза, a Listeria monocytogenes или Streptococcus agalactiae - небольшие, диффузные зоны. Для определения гемолитической активности не следует применять шоколадный агар (ША), так как образующиеся зоны α- или β-гемолиза не имеют характерных особенностей и вызывают одинаковое позеленение среды.
Размеры и форма колоний
Важные признаки колоний - их размеры и форма. Колонии могут быть большими или мелкими. Величина колоний - признак, позволяющий различать различные виды, роды и даже типы бактерий.
В большинстве случаев колонии грамположительных бактерий мельче колоний грамотрицательных бактерий. Колонии бактерий могут быть плоскими, приподнятыми, выпуклыми, иметь вдавленный или приподнятый центр. Другой важный признак - форма краёв колоний. При изучении формы колоний учитывают характер её поверхности: матовый, блестящий, гладкий или шероховатый. Края колоний могут быть ровными, волнистыми, дольчатыми (глубоко изрезанными), зубчатыми, эрозированными, бахромчатыми и т.д. Размеры и формы колоний часто могут изменяться. Подобные изменения известны как диссоциации. Наиболее часто обнаруживают S — и R — duc социации. S-колонии круглые, гладкие и выпуклые, с ровными краями и блестящей поверхностью. R-колонии - неправильной формы, шероховатые, с зубчатыми краями.
Цвет колоний
При просмотре посевов также обращают внимание на цвет колоний. Чаще они бесцветные, белые, голубоватые, жёлтые или бежевые; реже - красные, фиолетовые, зелёные или чёрные. Иногда колонии ирризируют, то есть переливаются всеми цветами радуги. Окрашивание возникает в результате способности бактерий к пигментообразованию. На специальных дифференцирующих средах, включающих специальные ингредиенты или красители, колонии могут приобретать разнообразную окраску (чёрную, синюю и др.) за счёт включения красителей либо их восстановления из бесцветной формы. В данном случае их окраска не связана с образованием каких-либо пигментов.
Консистенция колоний и особенности роста на среде
Полезную информацию могут дать консистенция колоний и особенности роста на среде. Обычно эту информацию можно получить при прикосновении к колониям петлёй. Колонии могут легко сниматься со среды, врастать в неё или вызывать её коррозию (образуя трещины и неровности). Консистенция колоний может быть твёрдой или мягкой.Мягкие колонии - маслянистые или сливкообразные; могут быть слизистыми (прилипают к петле) или низкими (тянущимися за петлёй).
Твёрдые колонии - сухие, восковидные, волокнистые или крошковатые; могут быть хрупкими и ломаться при прикосновении петлёй.
Запах - менее важный признак колоний, поскольку вызываемые им ассоциации носят субъективный характер. В частности, культуры синегнойной палочки имеют запах карамели, культуры листерий - молочной сыворотки, протеев - гнилостный запах, нокардий - свежевскопанной земли.
Биохимические методы идентификации бактерий
Методов, используемых для идентификации особенностей метаболизма бактерий, очень много, но на практике применяют небольшое их количество. Большинство способов основано на использовании дифференциально-диагностических сред, включающих различные индикаторы.
Способность к ферментации углеводов
Способность к ферментации углеводов оценивают по изменению окраски среды вследствие образования органических кислот (соответственно, происходит уменьшение рН), вызывающих изменение окраски индикатора.
«Пёстрый» ряд. Для определения сахаролитической активности применяют среды Хисса; в их состав входят 1% пептонная вода (или МПБ), индикатор Андраде и один из углеводов. При расщеплении углевода происходит изменение цвета среды с жёлтого на красный. Поскольку бактерии различают по способности ферментировать те или иные углеводы, то ряды пробирок приобретают пёстрый вид. Поэтому этот набор сред и называют «пёстрый» (или цветной) ряд.
Стеклянные поплавки. Для определения способности микроорганизмов ферментировать углеводы с образованием кислоты и газа в сосуды со средами вносят стеклянные поплавки (запаянные с одного конца короткие трубочки), всплывающие после наполнения их газом.
Расщепление белков
Некоторые бактерии проявляют протеолитическую активность, выделяя протеазы, катализирующие расщепление белков. Наличие протеолитических ферментов из группы коллагеназ определяют при посеве уколом в МПЖ. При положительном результате наблюдают его разжижение в виде воронки либо послойно сверху вниз. Способность к расщеплению белков и аминокислот также можно оценивать по изменению окраски среды, так как образующиеся продукты - аммиак, индол и сероводород - сдвигают рН в щелочную сторону, вызывая изменение окраски индикатора.
Образование аммиака. Для определения способности к образованию NH3 проводят посев в МПБ, и между его поверхностью и пробкой закрепляют полоску лакмусовой бумаги. При положительном результате бумажка синеет.
Образование индола и H2S. Обычно для определения способности к образованию индола и сероводорода также проводят посев в МПБ, между его поверхностью и пробкой закрепляют бумажки: в первом случае пропитанные раствором щавелевой кислоты (при образовании индола бумажка краснеет),во втором - раствором ацетата свинца (при образовании H 2 S бумажка чернеет).Также используют специальные среды, содержащие индикаторы (например, среда Клиглера), либо их вносят непосредственно в среду после регистрации видимого роста бактерий.
Тест на нитратредуктазную активность
Этот тест используют для идентификации отдельных видов бактерий. Он позволяет определить способность восстанавливать нитраты в нитриты. Способность к восстановлению NO3 в N02, определяют культивированием в МПБ, содержащем 1% раствор KNO3. Для определения нитритов в среду добавляют несколько капель реактива Грисса. При положительном результате наблюдают появление красного кольца.
Хроматография
Хроматографические методы используют для идентификации бактерий и установления их систематического положения. Объекты для исследования - жирные кислоты клеточной стенки, уникальные интермедиаты и конечные метаболиты жизнедеятельности бактерий. Хроматографические системы обычно сопрягают с компьютерами, что значительно упрощает учёт результатов. Наиболее распространена идентификация жирных короткоцепочечных и тейхоевых кислот методом газожидкостной хроматографии. Жидкостной хроматографией под высоким давлением идентифицируют миколевую кислоту в клеточных стенках микобактерий. Тонкослойную хроматографию используют для идентификации изопреноидных хинонов клеточной стенки бактерий. У различных родов их содержание и набор различны, но постоянны, что позволяет установить систематическое положение каждого конкретного вида.
Индикаторные бумажки
Для изучения биохимической активности бактерий широко применяют системы индикаторных бумажек или наборы мультимикротестов.
Система индикаторных бумажек (СИБ) - набор дисков, пропитанных различными субстратами. Их можно непосредственно вносить в пробирки со взвесью бактерий либо предварительно поместить в лунки пластиковых планшетов, куда будут внесены исследуемые бактерии. Так, на практике применяют наборы Minitek Enterobacteriaceaelll и Minitek Neisseria для дифференциальной диагностики энтеробактерий (четырнадцать субстратов) и нейссерий (четыре субстрата), позволяющие получить результаты через 4 ч инкубации при 37 °С.
Наборы мультимикротестов - пластиковые планшеты, в лунки которых помещены различные субстраты и индикаторы. В лунки вносят различные разведения бактерий и инкубируют при 37 °С. На практике используют тесты RapID NH для идентификации нейссерий и гемофилов, RapID Е для энтеробактерий и др., позволяющие получить результаты не позднее 4-8 ч.
Автоматические системы идентификации бактерий
Автоматические системы идентификации бактерий позволяют быстро (на 24-48 ч быстрее обычных методов) получить информацию о виде возбудителя заболевания и его чувствительности к антимикробным препаратам. В настоящее время наибольшее распространение получили системы типа Microscan и Vitek.
Системы Microscan.
Используют турбидиметрические, колориметрические и флюоресцентные методы идентификации бактерий. Системы состоят из комплектов пластиковых планшетов, содержащих различные субстраты. Грамположительные и грамотрицательные бактерии дифференцируют с помощью флюоресцирующих субстратов (время анализа - 2 ч). Для идентификации гемофилов, анаэробов и дрожжей используют хромогенные субстраты, изменяющие свою окраску (время анализа - 4-6 ч). Минимальные ингибирующие концентрации различных антибиотиков определяют по изменению оптической плотности. Система компьютеризирована и автоматически проводит все необходимые расчёты.
Системы Vitek.
В этой системе применяют один тип планшетов с тридцатью лунками. В каждую лунку автоматически вносится суспензия бактерий с известной концентрацией микробных тел. Идентификация микроорганизмов (гемофилы, нейссерии, дрожжи и анаэробы) основана на турбидометрии реакционной среды в лунке. В зависимости от свойств микроорганизма время, необходимое для его идентификации, варьирует от 4-8 до 18 ч. Система полностью компьютеризирована и работает автоматически.
Методы идентификации нуклеиновых кислот
Методы выявления РНК и ДНК возбудителей нашли применение в основном при диагностике вирусных инфекций. Тем не менее разработаны тест-системы для идентификации некоторых прихотливых бактерий (например, легионелл, хламидий), а также для идентификации колоний Neisseha gonorrhoeae, Haemophilus influenzae типа b, стрептококков группы В, энтерококков и микобактерий.
Гибридизация нуклеиновых кислот
Наиболее распространены методы гибридизации нуклеиновых кислот. Принцип методов обусловлен способностью ДНК (и РНК) специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (и РНК), меченных изотопами или ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). В дальнейшем образцы исследуют различными методами (например, ИФА).
Метод гибридизации в растворах даёт наиболее быстрые результаты. Широкому внедрению метода препятствует проблема удаления не связавшихся нитей нуклеиновых кислот.
Метод гибридизации на твёрдой основе и его сэндвич- модификация распространён больше. В качестве твёрдой основы служат мембраны из нитроцеллюлозы или нейлона. Не связавшиеся реагенты удаляют многократным отмыванием.
Биохимическая идентификация бактерий с помощью тест-систем
Другие варианты подобных тест-систем предусматривают адсорбцию дифференцирующих субстратов на бумажных или полимерных носителях. Среди них распространены системы Auxtab, Minitek, Morlok, MICRO-ID.
Подобные системы удобны в пользовании, они позволяют одновременно исследовать широкий спектр микробных признаков, всегда готовые к использованию в любых микробиологических лабораториях, они простые и надежные, требуют небольших объемов посевного материала, потому экономят лабораторную посуду, пипетки. Компьютерная обработка полученных результатов дает возможность быстро определить и оценить вид неизвестного возбудителя.
Изготовление питательных сред. В состав любых сред входят преимущественно натуральные животные или растительные продукты и компоненты – мясо, рыбная мука, яйца, молоко, кровь, дрожжевой экстракт, картофель и тому подобное. Из них готовят специальные полуфабрикаты в виде экстрактов, настоев, ферментативних и кислотных гидролизатів (мясная вода, дрожжевой экстракт, триптичнийгидролизатХоттингера, пептон и другие), которые являются основой для последующего конструирования питательных сред. Кроме этого, в питательные среды добавляют разные неорганические соли в зависимости от потребностей микробной клетки. Как правило, концентрация хлорида натрия составляет 5,0 г/л, KH2PO4 – 0,2-0,5 г/л, MgSO4·7H2O, другие соли добавляются из расчета 0,001 г/л. В необходимых случаях к составу вводят углеводы (сахара, многоатомные спирты), аминокислоты в концентрации 0,5-1,0 %, а также витамины (до 0,001 мг/мл).
Для обеспечения необходимой плотности среды используют агар-агар, который получают из морских водорослей. Он является удобным и необходимым компонентом сред, поскольку не потребляется бактериями как ростовой субстрат. Образовывая в воде гель, он плавится при температуре возле 100 °С, а густеет при 40 °С. Источником желатина являются богатые на коллаген субстраты. Среди них хрящи, сухожилия, кости и тому подобное. Гель, который получают в результате использования желатина, плавится при температуре возле 32-34 °С и застывает при 28 °С. Однако многочисленные микроорганизмы способны расщеплять желатин, потому использование последнего как наполнителя среды считается нецелесообразным. Чаще всего такие среды с желатином применяются для определения протеолитических свойств бактерий.
Изготовление питательных сред является сложным динамическим процессом, который нуждается во внимании бактериолога. Этот процесс состоит из нескольких основных этапов. Сначала к дистиллированной воде согласно с прописью добавляют необходимые сухие компоненты среды, тщательным образом перемешивают, растворяя при нагревании. Обязательно устанавливают рН среды, которую определяют или с помощью іонометра, или индикаторными бумажками. При этом следует обратить внимание, что после стерилизации реакция среды падает на 0,2. Среды, которые содержат агар, фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем состоянии, жидкие среды – через бумажные фильтры. Если есть необходимость, их освітляють осаждением или с помощью белка куриного яйца или сыворотки. Среды разливают в специальные матрасы, колбы, флаконы и закрывают ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками. В зависимости от состава среды используют разные режимы стерилизации. Да, среды, которые содержат углеводы, желатин стерилизуют в автоклаве 15 мин при температуре 112 °С или текучей парой при температуре 100 °С дробно. Среды без углеводов можно стерилизовать в автоклаве при 115-120 °С в течение 20 мин. Если в состав сред входят неустойчивые к температуре компоненты, такие, как нативний белок, сыворотка, мочевина, то они стерилизуются или фильтрованием через бактериальные фильтры, или их добавляют готовым в стерильную среду. Контроль стерильности сред осуществляют путем витримування их в термостате в течение нескольких суток при температуре 37 °С.
Приводим примеры изготовления некоторых простых питательных сред, которые чаще всего используются в микробиологической практике и могут быть основой для изготовления более сложных.
Мясная вода . Для ее изготовления используют свежую говядину, которую предварительно очищают от жира, фасций, сухожилий и тому подобное, разрезают на мелкие куски и пропускают через мясорубку. Полученный фарш заливают водопроводной водой в соотношении 1:2, размешивают и на сутки оставляют в прохладном месте. Полученный настой кипятят в течение 30-60 мин, периодически снимая накипь, а затем отстаивают. Отделяют жидкость от фарша, фильтруют через фильтровальную бумагу или полотно и доливают водопроводной водой к первичному объему, потом разливают в флаконы и стерилизуют при 1 атмосфере (температура 120 °С) в течение 30 мин. Стерильная мясная вода прозрачна, имеет желтоватый цвет, а на стенках флакона и на дне образуется осадок из белков, которые свертывались. Потому при последующем использовании среды его опять фильтруют. Активная реакция среды – 6,2.
Мясо-пептонныйбульйон (МПБ). Чтобы изготовить МПБ, к мясной воде добавляют 1 % пептону и 0,5 % хлориду натрия, устанавливают необходимое рН с помощью 20 % раствору NAOH и кипятят 30-40 мин, постоянно перемешивая. Бульйон фильтруют через бумажный или полотняный фильтры, разливают в флаконы, пробирки, проверяют активную реакцию среды и стерилизуют при 120 °С в течение 20 мин.
М’ясо-пептоннийагар (МПА). К мясо-пептонного бульйону добавляют мелко нарезанный агар-агар (2-2,5 %). Полученную смесь кипятят к растворению агар-агара, фильтруют, устанавливают рН и разливают в флаконы. Стерилизацию проводят в течение 20 мин при температуре 120 °С.
Среды с кровью, сывороткой или асцитическойжидкостью. Поскольку эти среды не могут долго сохраняться, их готовят непосредственно перед применением. Для этого к растопленному и охлажденному до 45-50 °С МПА додают стерильно 5-10 % свежей или дефибринированной крови барана, кролика или другого животного. Флаконы с агаром тщательным образом перемешивают и разливают в чашки Петри, следя за отсутствия пены.
Идентично готовят сывороточный (5-10 % сыворотки крови) или асцитичныйагар (25 % асцитичной жидкости).
Триптичнийперевар за Хоттингером. Бульйон из него более экономический чем другие мясо-пептонные среды, поскольку позволяет из одной порции мяса получить в несколько раз больше бульйона. В этой среде содержится большое количество аминокислот, следовательно, повышается его буферність, и за счет этого стабильнее является значение активной реакции среды.
Для изготовления перевара берут один килограмм мяса без сухожилий и жира, порезанный на мелкие куски размером до 1-2 см, окунают в кастрюлю с двойным объемом воды, которая кипит, и кипятят 15-20 мин, пока мясо не станет серым, что свидетельствует о коагуляции белков. Его вынимают из жидкости и пропускают через мясорубку. В жидкости, которая осталась, устанавливают рН 8,0, опускают туда фарш и охлаждают до 40 °С. Потом добавляют 10 % (к объему жидкости) свежей поджелудочной железы, предварительно очищенной от соединительной ткани, жиру и дважды пропускают через мясорубку. Вместо железы используют сухой препарат панкреатина (0,5 %). Полученную смесь тщательным образом взбалтывают и доводят рН до 7,8-8,0. Через 30 мин проверяют рН. Если активная реакция среды не изменяется в кислую сторону, это свидетельствует о недоброкачественности фермента. Когда рН среды стабилизируется, смесь переливают в большие бутыли, заполняя их на 1/3. Добавляют до 3 % хлороформу, закрывают посуду резиновими пробками и интенсивно взбалтывают для перемешивания жидкостей. Избыток паров хлороформа выпускают. Через 1-2 год опять проверяют рН среды, устанавливая его на 7,4-7,6.
Добавить материал
Полученную смесь оставляют при комнатной температуре сроком до 16 дней. В течение первых 3-4 дней ежедневно проверяют и корректируют рН среды, а также взбалтывают флаконы не меньше, чем 3 разы в сутки. Позже эту процедуру можно не проводить и взбалтывать среду следует не так часто. За 1‑2 дня до окончания цикла переваривания взбалтывания среды прекращают.
О завершенном качественном переваривании свидетельствуют просветления жидкости, которая приобретает соломенно-желтый цвет, а также образование на дне пылевидного осадка. Жидкость легко фильтруется, ее проверяют на наличие триптофана с помощью пробы с бромной водой (до 3-4 мл фильтрата добавляют 3-4 капли бромной воды). При наличии триптофана (до 2,0-3,0 г/л) цвет среды изменяется на розово-фиолетовый. Определяют общий азот, который в норме достигает 11,0-12,0 г/л, и аминный азот (до 7,0-9,0 г/л).
Гидролизат фильтруют через бумажный или полотняный фильтр, разливают в бутыли и автоклавують при 120 °С в течение 30 мин. В таком виде он может сохраняться длительное время.
Его используют для получения бульйонаХоттингера. С этой целью до 100-200 мл гидролизат у добавляют 800-900 мл дистиллированной воды, 0,5 % хлориду натрия и 0,2 % однозамещенного фосфорнокислого натрия. Доводят рН до 7,4‑7,6, разливают в флаконы и стерилизуют 20 мин при 120 °С.
Мясо-пептоннийагар на основе гидролизат уХоттингера готовят за рецептурой обычного МПА.
Сегодня, как правило, бактериологи пытаются пользоваться стандартными сухими питательными средами, которые выпускает бактериологическая промышленность. Такие среды позволяют существенно улучшить результаты микробиологических исследований и стандартизировать их.
Для культивирования бактерий широко применяют безбелковые среды, в которых хорошо растут много органотрофних, в том числе патогенных видов бактерий. В эти среды входят много компонентов.
Культивирование в синтетических средах с использованием метода меченых атомов дает возможность детальнее дифференцировать бактерии за характером их биосинтеза.
Для дифференциации прототрофних и ауксотрофних бактерий широко используют селективные среды .
Прототрофы растут на минимальной среде, которая содержит только соли и углеводы, поскольку они сами могут синтезировать нужные им для развития метаболиты, тогда как ауксотрофы нуждаются в среде, которая содержит определенные аминокислоты, витамины и другие вещества.
На густых питательных средах бактерии образуют разные по форме и величине колонии - видимые скопления микроорганизмов одного вида, которые формируются в результате размножения из одной или нескольких клеток. Колонии бывают плоскими, выпуклыми, куполообразными, вдавленными, их поверхность - гладкой (S-фор-ми), шершавой (R-формы), исчерченной, бугорчатой, края - ровными, зазубренными, волокнистыми, бахромчатыми. Форма колоний также разнообразна: круглая, розеткообразная, звездчатая, деревовидная. По величине (диаметру) колонии разделяются на большие (4- 5 мм, средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (меньше 1 мм).
13.1.3 Сальмонеллы
В 1880 г. немецкий исследователь К. Эберт впервые описал бактерию – возбудителя брюшного тифа. В 1884 г. данный микроорганизм был выделен и тщательно изучен Г. Гаффки.
Сходный возбудитель, вызывающий заболевание у свиней, в 1885 г. обнаружен Д. Сэлмоном. Впоследствии весь род, к которому принадлежат данные бактерии, получил название Salmonella , а возбудитель был назван S. choleraesuis .
Далее были выявлены сальмонеллы – возбудители заболеваний животных и пищевых токсикоинфекций у человека – S. enteritidis (А. Гартнер, 1888 г.) и S. typhimurium (К. Кенш и Э. Нобел, 1898 г.).
Позднее в 1900 г. Г. Шоттмюллер детально исследовал сальмонелл – возбудителей паратифозных инфекций человека – S. paratyphi B или S . schottmuelleri . В свою очередь, возбудитель паратифа А был выделен и изучен А. Брионом и Г. Кайзером.
Классификация
Согласно современной таксономии род Salmonella включает в себя всего 2 вида – S . enterica и S . bongori . Патогенные представители относятся только к виду S . enterica .
Вид S. enterica включает подвиды enterica , salamae , arizonae , diarizonae , houtenae и indica . Более 99% заболеваний у человека вызывается сальмонеллами подвида enterica .
Сальмонеллы чрезвычайно вариабельны в антигенном отношении. Известно более 2500 сероваров. Длительное время серовары бактерий считались разными видами, которые обозначались отдельно.
Собственные наименования имеются только у сероваров подвида enterica . При этом названия большинства их вариантов стали общеупотребительными в медицинской практике.
Серовары других подвидов обозначаются номерами.
У человека сальмонеллы вызывают антропонозные (брюшной тиф, паратифы ) и зооантропонозные инфекции (сальмонеллезы ).
Возбудителем брюшного тифа является S. enterica серовар Typhi. Его краткое название с учетом названия серовара – S. Typhi (обозначается шрифтом без курсива с заглавной буквы).
Возбудители паратифозных заболеваний – S. Paratyphi A, S. Paratyphi В, S. Paratyphi С.
Основными сероварами, вызывающими сальмонеллезы, являются S. Enteritidis и S. Typhimurium. Многие другие варианты также могут вызывать эти болезни (S. Choleraesuis, S. Heidelberg, S. Derby и др.)
Морфология
Все сальмонеллы – грамотрицательные подвижные палочки имеют множественные пили и жгутики (перитрихи), спор не образуют, могут иметь полисахаридную капсулу.
Культуральные свойства
Факультативные анаэробы, хемоорганотрофы.
Способны расти при температуре от 8 до 45 0 С.
Хорошо размножаются на простых питательных средах. На МПА образуют полупрозрачные, бесцветные колонии.
Среды с желчью являются селективными (желчный бульон, жидкая среда Рапопорт с глюкозой, солями желчных кислот и индикатором Андраде). Способны расти на селенитовом бульоне.
В жидкой среде S-формы вызывают равномерное помутнение.
На дифференциально-диагностических средах Эндо, Левина, МакКонки образуют бесцветные колонии, т.к. сальмонеллы не разлагают лактозу.
Селективной средой для сальмонелл служит висмут-сульфит-агар, где они растут в виде черных блестящих колоний.
Биохимические свойства
Сальмонеллы ферментируют углеводы (глюкозу, мальтозу, маннит, арабинозу, маннозу) с образованием кислоты и газа. Не ферментируют лактозу, сахарозу.
В отличие от остальных сероваров S.Тyphi не выделяет газ при ферментации углеводов.
При расщеплении белков образуют сероводород, за исключением S. Paratyphi A. Индол не образуют.
Оксидазоотрицательны, каталазоположительны
Антигенная структура и классификация Кауфмана-Уайта
Сальмонеллы имеют 3 основных антигена: О-АГ, Н-АГ, некоторые – капсульный Vi-АГ.
О-антиген термостабильный, выдерживает кипячение в течение 2,5 часов. Это ЛПС клеточной стенки, обладающий свойствами эндотоксина.
Н-антиген – жгутиковый, термолабильный, разрушается при температуре 75-100 о С. Представляет собой белок флагеллин.
В отличие от других энтеробактерий, имеет 2 фазы : первая – специфическая и вторая – неспецифическая . Фазы представляют собой отдельные антигены, которые определяются разными генами. Большинство сальмонелл двухфазны. Есть монофазные сальмонеллы, экспрессирующие лишь один вариант Н-АГ.
Ф. Кауфман и П. Уайт классифицировали сальмонеллы по антигенной структуре.
По О-АГ все сальмонеллы делятся на 67 групп (А, В, С, D, Е и т.д.) В одну группу входят сальмонеллы, имеющие общую детерминанту О-антигена, обозначенную цифрой.
По Н-АГ внутри групп сальмонеллы делятся на серовары. Специфическая 1 фаза Н-антигена обозначается латинскими строчными буквами, 2 фаза – арабскими цифрами (или вместе с латинскими буквами). По 1-й фазе Н-антигена происходит непосредственное определение серовара.
Vi-АГ принадлежит к группе поверхностных или капсульных АГ. В большинстве случаев обнаруживается только у S.Тyphi, редко у S.Paratyphi C и S. Dublin.
Он термолабилен, полностью разрушается при кипячении в течение 10 минут, частично инактивируется при температуре 60 о С в течение 1 часа.
Сальмонеллы, имеющие Vi-антиген, лизируются брюшнотифозными Vi-бактериофагами. Фаготипирование проводят с целью установления источника инфекции, что имеет эпидемиологическое значение. Известно около 100 фаготипов. Полисахарид Vi-АГ обеспечивает специфическое взаимодействие с Vi-фагами.
Факторы патогенности
Сальмонеллы имеют не менее 10 генетических островков патогенности, которые могут встречаться у многих возбудителей. Кроме того, S.Тyphi обладает главным островом патогенности , отличающим ее от остальных представителей.
В патогенезе инфекций ведущую роль играют два основных острова патогенности SPI -1 и SPI -2 , локализованные в нуклеоиде. Часть генов этих островов получена в результате трансдукции умеренных бактериофагов.
Оба острова отвечают за образование структур III типа секреции (инжектисом и эффекторных белков инвазии), однако эти структуры различны.
Эффекторные молекулы острова SPI -1 отвечают за проникновение возбудителя в клетки эпителия и развитие энтероколита.
Часть из них образует инжектисому (или иглокомплекс ). Остальные после контакта бактерий с эпителием при помощи инжектисомы попадают внутрь клеток.
Они перестраивают актин клеточного цитоскелета, что приводит к образованию складок на поверхности М-клеток пейеровых бляшек и эпителия кишечника. Тем самым эпителиальные клетки приобретают способность к захвату бактерий, которые проникают внутрь макропиноцитозом.
Кроме того, белки вирулентности острова SPI-1 активируют мембранные каналы в эпителии, что усиливает секрецию хлоридов и приводит к диарее.
При попадании в макрофаги эти молекулы активируют каспазу-1. С одной стороны, это стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов (ИЛ 1, хемокина нейтрофилов ИЛ 8 и др.) С другой стороны – активируется гибель макрофагов посредством апоптоза. Тем самым эти белки вызывают иммуновоспалительный процесс в кишечной стенке с проникновением туда нейтрофилов.
Эффекторные молекулы другого острова патогенности SPI -2 ответственны за выживание бактерий внутри фагоцитов и клеток пораженных органов. Тем самым они определяют развитие не местной, а системной инфекции при сальмонеллезе.
Белки острова SPI-2 также образуют инжектисому . После попадания возбудителя в фагоцит, он находится внутри вакуоли, где способен размножаться. Эффекторные молекулы подавляют ферменты дыхательного взрыва, что обеспечивает длительное выживание бактерий. Кроме того, эти белки поддерживают структуру стенки вакуолей, содержащих сальмонеллы.
Еще один остров патогенности SPI -3 кодирует ферменты, обеспечивающие сальмонелл катионами магния. Это также необходимо для выживания бактерий внутри фагоцитов.
Сальмонеллы при разрушении выделяют эндотоксин , который через TLR-4 рецепторы на клетках стимулирует выделение провоспалительных цитокинов. Обладает пирогенным действием, повреждает эндотелий сосудов.
Часть возбудителей способна продуцировать энтеротоксины , которые вызывают секреторную диарею.
Главный остров патогенности S.Тyphi определяет инвазивность возбудителя, а также способность к продукции капсульного Vi-АГ.
Две плазмиды S.Тyphi содержат гены устойчивости к антибиотикам. Кроме того, часть сальмонелл имеет набор генов множественной устойчивости к антибиотикам, которые находятся в нуклеоиде.
Резистентность
Во внешней среде сальмонеллы долго сохраняют свою жизнеспособность: в воде открытых водоемов они живут до 120 суток, в морской воде – до месяца, в почве до 9 месяцев, в комнатной пыли до 1,5 лет, в колбасных изделиях 2-4 месяца, в замороженном мясе и яйцах до 1 года. В продуктах сальмонеллы не только сохраняются, но и размножаются (молоко, сметана, творог, мясной фарш). В заражении пищевых продуктов могут играть роль мухи.
Бактерии хорошо переносят низкие температуры, однако чувствительны к высоким – при нагревании до 60 0 С погибают через 30 минут, при 100 0 С – почти мгновенно. Дезинфицирующие средства (хлорамин, гипохлорит, лизол) в обычных концентрациях убивают возбудителей через несколько минут.
Характеристика заболеваний
Сальмонеллами вызываются 3 группы поражений: брюшной тиф и паратифы , сальмонеллезные гастроэнтериты и септицемии . Развитие их зависит от вирулентности возбудителя, его инфицирующей дозы и состояния иммунитета макроорганизма. Для возникновения брюшного тифа требуется 10 3 -10 5 микробных клеток. Для развития сальмонеллезов инфицирующая доза существенно выше – 10 6 -10 9 бактерий, но при высокой вирулентности возбудителя или при иммунодефицитном состоянии человека количество бактерий может быть во много раз меньше.
Брюшной тиф и паратифозные заболевания
Брюшной тиф и паратифы – это острые инфекционные болезни, для которых характерно воспалительное повреждение тонкого кишечника с разрушением лимфоидной ткани и язвообразованием, бактериемия, лихорадка, общая интоксикация, увеличение селезенки и печени.
Наиболее тяжело протекает брюшной тиф.
Это заболевание представляют собой серьезную проблему для здравоохранения, особенно в развивающихся странах. Ежегодно в мире возникает от 15 до 30 млн случаев брюшного тифа, при этом регистрируется от 250 до 500 тыс. летальных исходов. В развивающихся странах в основном болеют дети и лица молодого возраста. В развитых странах заболевание встречается в виде спорадических случаев.
Брюшной тиф и паратиф А – антропонозные инфекции , резервуаром которых является человек. Возбудители паратифов В и С выделены также от некоторых животных и птиц.
Источниками инфекции являются больные или бактерионосители, которые выделяют возбудителя с испражнениями, мочой, слюной. Основной механизм заражения – фекально-оральный (пути водный, пищевой и контактно-бытовой).
Период инкубации может длиться до 2-3 недель.
При попадании через рот, преодолев защитные барьеры желудка, бактерии проникают в тонкую кишку (фаза инфицирования ). В патогенезе важнейшую роль играют инвазивные белки системы III типа секреции (см. выше). Некоторые из белков инвазии проявляют транслоказную активность – образуют инжектисому и обеспечивают проникновение сальмонелл внутрь эпителиальных М-клеток и энтероцитов. Остальные блокируют метаболизм зараженных клеток, приводя к нарушению их функции. Происходит усиление выработки хемокинов (например, ИЛ-8), других провоспалительных цитокинов энтероцитами и макрофагами кишечника.
Сальмонеллы сохраняют жизнеспособность в вакуолях пораженных клеток и вызывают апоптоз макрофагов, активируя каспазу-1.
В результате нарушения гемолимфатического барьера сальмонеллы попадают в кровь (фаза бактериемии ). Возбудители брюшного тифа выживают и размножаются в фагоцитах, а после гибели последних в больших количествах попадают в кровь. При этом Vi-АГ ингибирует действие сывороточных и фагоцитарных бактерицидных факторов.
В это время появляются клинические симптомы заболевания (первая неделя болезни ). Температура повышается до 39-40 о. Под влиянием бактерицидных свойств крови и вследствие фагоцитоза сальмонеллы разрушаются, освобождается эндотоксин , который поражает сосуды микроциркуляции и обладает выраженным нейротропным действием. В тяжелых случаях в результате поражения ЦНС возникает status t y phosus (сильная головная боль, бессонница, резкая слабость, апатия, нарушение сознания, вплоть до комы). Поражение кишечника сопровождается отеком, слущиванием эпителия. Расстройство вегетативной нервной системы сопровождается метеоризмом, болями в животе. Развивается диарея.
На 2 неделе заболевания (разгар болезни ) сальмонеллы с кровью разносятся по внутренним органам, поражают печень, желчный пузырь, селезенку, почки, на коже появляется сыпь. Со 2-й недели сальмонеллы с желчью вновь попадают в тонкий кишечник, лимфоидные образования которого уже сенсибилизированы антигенами сальмонелл. В результате возникает аутоиммунная воспалительная реакция , иногда образуются некрозы в местах скопления лимфоидных клеток. Следствием некрозов слизистой оболочки могут быть кровотечения, перфорация кишечника.
После разгара болезни происходит постепенное угасание клинических проявлений з аболевания. Выделение возбудителей из организма происходит с фекалиями, мочой, потом, слюной, грудным молоком (у кормящих женщин). Иммунный ответ обеспечивает постепенную элиминацию сальмонелл.
Пациенты, получавшие антибиотики, выписываются из стационара не ранее 21-го дня нормальной температуры. Перед выпиской проводят трехкратное бактериологической исследование фекалий и мочи и однократное исследование желчи.
Обычно заболевание завершается выздоровлением . Летальность не превышает 0,5-1%. Тем не менее, в отсутствие адекватной медицинской помощи при отдельных вспышках брюшного тифа в тропических странах летальность превышала 30%.
Паратифы А и В протекают более благоприятно. Клиническая симптоматика их сходная. В целом для этих болезней характерно более легкое течение в сравнении с брюшным тифом.
Иммунитет
После перенесенной инфекции иммунитет в целом стойкий, но могут быть рецидивы и повторные заболевания.
Не всегда выздоровление заканчивается полным освобождением от возбудителя. Более чем у 2% пациентов наблюдается бактерионосительство. Поскольку бактерии устойчивы к желчи, то они концентрируются желчном пузыре, изолированно от действия факторов иммунитета. Такие возбудители продуцируют повышенное количество Vi-АГ. Способны персистировать внутри макрофагов.
Бактерионосители опасны как источники инфекции. Они могут сохранять возбудителей многие месяцы. У хронических носителей выявлен дефицит IgM-антител против О-АГ.
Носительство паратифозных возбудителей формируется чаще, чем при брюшном тифе, однако оно менее длительно – в пределах нескольких недель.
Лабораторная диагностика брюшного тифа
Используют бактериологический и серологические методы , которые проводят с учетом периода инфекционного процесса.
Материалом для выделения являются кровь (гемокультура ), испражнения (копрокультура ), моча (уринокультура ), дуоденальное содержимое, желчь (биликультура ), соскоб розеол, костный мозг.
В бактериологическом исследовании ранним методом является выделение возбудителя из крови (гемокультура) в период бактериемии (первая неделя заболевания).
Кровь засевают в желчный бульон или среду Рапопорт в соотношении 1:10 (чтобы уменьшить бактерицидные свойства белков крови). На 2-й день проводят пересев на среду Эндо или Левина, или висмут-сульфит агар. Подозрительные (прозрачные или черные в зависимости от сред) колонии пересевают на скошенный агар или одну из комбинированных сред (Олькеницкого, Ресселя, Клиглера). На этих средах для первичной идентификации определяют ферментацию глюкозы, способность к газообразованию, выделение сероводорода, отсутствие уреазы.
Одновременно изучают морфологию и тинкториальные свойства.
Определяют биохимические свойства. Бактерии тифо-паратифозной группы не разлагают сахарозу, лактозу, не образуют индол.
При выделении культур, имеющих характерные для сальмонелл ферментативные свойства, изучают их антигенную структуру в реакции агглютинации на стекле с О- и Н-диагностическими антисыворотками, определяют чувствительность к антибиотикам, проводят фаготипирование.
Для серологической диагностики брюшного тифа и паратифов с 5-7 дня заболевания в основном используется РПГА с О- и Н-эритроцитарными диагностикумами. Положительной считается реакция в титре 1:160 и выше. При исследовании в РПГА титр антител в динамике заболевания нарастает.
Возможно применение реакции агглютинации Видаля с О- и Н-монодиагностикумами к конкретным возбудителям (положительный титр реакции – 1:200 и выше). Серологический диагноз имеет ретроспективный характер.
Для выявления бактерионосителей используют РПГА с эритроцитарным Vi-диагностикумом (титр реакции – 1:40). Исследуют били- и копрокультуру. Проводят фаготипирование с Vi-1 антигеном.
При эпидемических вспышках брюшного тифа для экспресс-диагностики с целью выявления АГ в крови, костном мозге и другом материале применяют РИФ и ИФА.
Лечение брюшного тифа
Этиотропную терапию проводят сразу после установления клинического диагноза. Для лечения используют фторхинолоны. При устойчивости к ним применяют цефалоспорины III поколения, азитромицин.
Левомицетин и ко-тримоксазол в настоящее время используют реже из-за распространения полирезистентных штаммов. Патогенетическое лечение включает инфузионно-дезинтоксикационную терапию.
Профилактика
Проводятся санитарно-гигиенические и противоэпидемические мероприятия, направленные на обезвреживание источников инфекции, пресечение путей передачи, повышение невосприимчивости организма.
Для специфической иммунопрофилактики брюшного тифа разработано 3 типа вакцин. Применяют инактивированные вакцины (эффективность 50-70%), разработана живая аттенуированная вакцина из штамма Ту21а (оказывает большее протективное действие, находится на стадии клинических испытаний). Эффективной является полисахаридная вакцина из Vi-антигена S. typhi (например, Вианвак пр-ва Российской Федерации), применяется по эпидпоказаниям, протективный эффект сохраняется до 2-х лет.
Сальмонеллезы
Сальмонеллезы – группа полиэтиологичных острых инфекционных болезней человека, животных и птиц, характеризующаяся преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта, диареей и бактериемией.
Наиболее частой клинической формой сальмонеллезной инфекции является сальмонеллезный гастроэнтерит . Основные возбудители гастроэнтерита: S. Enteritidis, S .Choleraesuis, S .Anatum, S .Derby, хотя заболевания могут вызываться и многими другими вариантами бактерий.
Значительно более тяжелой формой является генерализованная сальмонеллезная инфекция – септицемия . Ее ведущим возбудителем является S. Typhimurium.
Большинство возбудителей выделяют у различных животных (основной резервуар) и человека.
Источником заражения человека чаще всего являются домашние птицы (50%), особенно куры и утки, а также их яйца (сальмонеллы могут проникать через скорлупу внутрь). Носительство сальмонелл выявлено у домашнего скота, собак, кошек, грызунов, у многих диких животных и птиц. Инфицированные животные выделяют бактерии с мочой и калом, молоком, слюной, загрязняя окружающую среду.
Основной путь передачи сальмонелл – пищевой. Заболевания возникают у человека в связи с употреблением мясных продуктов (говядина, свинина – до 20% случаев, мясо птицы), яиц, реже – рыбы, овощей, фруктов, моллюсков, раков, крабов.
Мясо может инфицироваться эндогенно при жизни животного во время его болезни, а также экзогенно в процессе транспортировки, переработки, хранения. Иногда продукты питания инфицируются при неправильной их кулинарной обработке, приготовлении пищи.
При несоблюдении санитарно-гигиенических норм может возникнуть контактно-бытовой путь передачи, который характерен для внутрибольничных вспышек сальмонеллеза. Такие вспышки отмечены в родовспомогательных учреждениях, хирургических, детских и других стационарах. При госпитальных сальмонеллезах чаще выделяется S. typhimurium и S. Haifa. В Республике Беларусь сальмонеллезные инфекции составляют более 50% от всех случаев госпитальных инфекций
Возбудители госпитальных сальмонеллезов отличаются высокой полирезистентностью к химиотерапевтическим препаратам и антибиотикам.
Наиболее восприимчивы к сальмонеллезу дети в возрасте до 1 года и лица с различными иммунодефицитами.
Инкубационный период болезни – от 2-6 часов до 2-3 суток (в среднем составляет 7-24 часа).
Патогенез сальмонеллезов определяется факторами вирулентности возбудителей. Среди них наиболее важную роль играют инвазивные белки III типа секреции.
Некоторые из белков инвазии обеспечивают проникновение сальмонелл внутрь эпителиальных клеток кишечника, их выживание внутри вакуолей. Кроме того, они стимулируют выброс провоспалительных цитокинов и хемокинов из пораженных клеток, апоптоз макрофагов.
Внутри макрофагов бактерии не только размножаются, но и частично погибают с освобождением эндотоксина, поражающего нервно-сосудистый аппарат кишечника и повышающего проницаемость клеточных мембран.
В течение 1 часа от проникновения сальмонелл внутрь клеток развивается выраженная нейтрофильная инфильтрация стенки кишечника. Кишечное воспаление сопровождается выходом белка из пораженных энтероцитов, усилением секреции хлоридов с развитием профузной диареи.
Часть сальмонелл может продуцировать энтеротоксин, который через повышение содержания цАМФ в энтероцитах стимулирует экскрецию хлоридов, что усугубляет диарею.
В большинстве случаев на этой стадии инфекционный процесс может завершиться (гастроинтестинальная форма ).
В тяжелых случаях возникает бактериемия и генерализация инфекции, что приводит к септицемии .
Эта форма сальмонеллеза наиболее характерна для S. Typhimurium и S. Enteritidis. Ее развитие обусловлено белками вирулентности, которые кодируются островом патогенности SPI -2 . Данные белки подавляют фагоцитоз, что обеспечивает выживание и размножение бактерий внутри фагоцитов, их проникновение в кровь и паренхиматозные органы.
В результате сальмонеллы могут вызывать дистрофические изменения в пораженных органах (селезенка, печень) с формированием вторичных гнойных очагов.
Обычно болезнь заканчивается выздоровлением, однако септические формы инфекции могут приводить у летальным исходам.
Иммунитет
Постинфекционный иммунитет непродолжительный, нестойкий, типоспецифический. В сыворотке больных и реконвалесцентов обнаруживаются агглютинины, преципитины, бактериолизины и другие антитела. Заболевание, вызванное одним сероваром, не создает иммунитета к другим, а перенесенная инфекция не исключает реинфекцию.
Лабораторная диагностика сальмонеллеза
Основой диагностики является бактериологический метод . Для исследования берут различные материалы : испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, мочу, остатки пищи, а также исходные продукты, использованные для ее приготовления; смывы с различного оборудования и предметов.
Для диагностики септицемии исследуют кровь.
В качестве сред обогащения используют селенитовый бульон, селенитовый агар, 20% желчный бульон. Среди дифференциально-диагностических сред для первичных посевов и высевов со сред обогащения выделяют селективные среды (висмут-сульфитный агар или агар с бриллиантовым зеленым) и дифференциально-диагностические (Эндо и Левина). Подозрительные колонии пересевают в пробирки с одной из комбинированных сред (Олькеницкого, Клиглера, Ресселя) и на скошенный МПА.
Изучают морфологические, тинкториальные, биохимические свойства возбудителей.
С культурами, выросшими на МПА, проводят серологическое типирование по схеме Кауфмана-Уайта. Ставят реакцию агглютинации на стекле с О- и Н-агглютинирующими антисыворотками. По результатам реакции устаналивают ставят окончательный бактериологический диагноз.
Серологическая диагностика используется редко (РА, РПГА).
Разработаны методы ИФА для обнаружения антигенов сальмонелл в крови и моче.
Лечение
Патогенетическая терапия сальмонеллезов направлена на дезинтоксикацию, восстановление водно-электролитного баланса и гемодинамики. Антибактериальная терапия при нетяжелых формах гастроэнтерита не показана. При генерализованной инфекции назначаются фторхинолоны, при устойчивости к ним –цефалоспорины III поколения (цефтриаксон).
В комплексном лечении сальмонеллезов возможно применить поливалентный сальмонеллезный бактериофаг.
Профилактика
Включает ветеринарно-санитарные, санитарно-гигиенические и противоэпидемические мероприятия. В случае возникновения внутрибольничной вспышки сальмонеллеза устанавливается особый режим работы лечебно-профилактического учреждения.
Вакцинопрофилактика не разработана.
| " |